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諾如病毒(諾瓦克病毒)
1．病原學(xué)
諾瓦克病毒（Norwalk Viruses，NV）是人類(lèi)杯狀病毒科(Human Calicivirus,，HuCV)中諾如病毒（Norovirus,NV）屬的原型代表株,。NV是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒,。諾瓦克病毒最早是從1968年在美國(guó)諾瓦克市暴發(fā)的一次急性腹瀉的患者糞便中分離的病原,。此后，世界各地陸續(xù)自胃腸炎患者糞便中分離出多種形態(tài)與之相似但抗原性略異的病毒樣顆粒,，均以發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)命名,，如：Hawaii Virus（HV）、Snow Mountain Virus（SMV）,、Mexico Virus（MxV）Southampton Virus（SOV）等,，先是稱(chēng)為小圓結(jié)構(gòu)病毒（Small Round Structural Virus,SRSV），后稱(chēng)為諾瓦克樣病毒（Norwalk-like virus,NLV）,直至2002年8月第八屆國(guó)際病毒命名委員會(huì)批準(zhǔn)名稱(chēng)為諾如病毒（Norovirus,NV）,。諾如病毒與在日本發(fā)現(xiàn)的札幌樣病毒（Sapporo-like Virus,，SLV），現(xiàn)在的正式名稱(chēng)為札如病毒(Sapovirus,SV),，合稱(chēng)為人類(lèi)杯狀病毒,。
NV有許多共同特征：直徑約為26～35nm，無(wú)包膜,，表面粗糙,，球形,，呈二十面體對(duì)稱(chēng)；從急性胃腸炎病人的糞便中分離,，不能在細(xì)胞或組織中培養(yǎng),，也沒(méi)有合適的動(dòng)物模型；基因組為單股正鏈RNA,；在氯化銫密度梯度中的浮力密度為1.36～1.41g/cm3,；電鏡下缺乏顯著的形態(tài)學(xué)特征，負(fù)染色電鏡照片顯示,，NV是具有典型的羽狀外緣,，表面有凹痕的小圓狀結(jié)構(gòu)病毒。
NV基因組是單股正鏈 RNA,，全長(zhǎng)約7642nt,，包括3 個(gè)開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs）,。ORF1編碼包括保守的具有RNA 多聚酶在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)蛋白,；ORF2 編碼分子量約為 56Kda的衣殼蛋白；ORF3 編碼一種分子量約為 22.5Kda 的強(qiáng)堿性微小結(jié)構(gòu)蛋白,。Pamela等人研究發(fā)現(xiàn)ORF3表達(dá)的部分區(qū)域蛋白與衣殼蛋白發(fā)生交互作用,，共同形成衣殼。
NV成員龐雜,，目前已對(duì)其 100 多個(gè)分離株進(jìn)行基因測(cè)序,。核酸的同源性分析表明，世界不同地區(qū),、不同時(shí)間流行的NV基因RNA多聚酶區(qū)序列相對(duì)保守,，核苷酸氨基酸序列同源性高于60%，有的達(dá)到90%以上,。因此,，根據(jù) RNA 多聚酶區(qū)核苷酸序列的相似性，將 NLV 分為 5 個(gè)基因組,其中感染人的包括基因組Ⅰ,、Ⅱ和IV：基因組Ⅰ,，以 Norwalk virus（NV）為代表，包括Southampton（SOV）,、Desert Shield virus（DSV）等,；基因組Ⅱ，以 Snow Mountain virus（SMV）代表,，包括 Hawaii Virus（HV）,、Mexico Virus（MxV）、Lordsdale virus（LV）等,；最近在動(dòng)物體中發(fā)現(xiàn)了感染豬和奶牛的基因組屬于基因組III和V,。
NV對(duì)熱,、乙醚和酸穩(wěn)定，室溫pH2.7環(huán)境下存活3h,，20%乙醚4℃處理存活18h,，60℃孵育30min仍有感染性，也耐受普通飲水中3.75～6.25ppm的Cl-濃度(游離氯0.5～1.0ppm),，但在處理污水的10ppm的Cl-濃度中被滅活,。
2．流行病學(xué)特征
NV腹瀉流行地區(qū)極為廣泛，20世紀(jì)70,、80年代世界上發(fā)生的非細(xì)菌性腹瀉暴發(fā)中19%～42%系NV所致,。在美國(guó)流行更加嚴(yán)重，1976～1981 年美國(guó)成人非細(xì)菌性急性胃腸炎暴發(fā)流行中有 42%是由NV引起的,，1996年1月～1997年6月美國(guó)疾病預(yù)防控制中心收到的90起非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)中,，96%是NV引發(fā)。荷蘭,、英國(guó),、日本、澳大利亞等國(guó)家也都得到類(lèi)似結(jié)果,。1995 年我國(guó)報(bào)道第1例NV感染起,，陸續(xù)對(duì)山西、北京,、安徽,、福州,、武漢,、廣州等地區(qū)NV感染暴發(fā)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果證明NV感染在我國(guó)是普遍存在的,。
NV感染全年均有流行,，感染對(duì)象主要是成人和學(xué)齡兒童，主要分布在學(xué)校,、家庭,、醫(yī)院、軍隊(duì),、幼兒園,、旅游區(qū)等，多在集體機(jī)構(gòu)以暴發(fā)形式出現(xiàn),，1996～2000年美國(guó)疾病預(yù)防控制中心接報(bào)348起暴發(fā),，136起發(fā)生在飯店，101起在療養(yǎng)院或醫(yī)院,，42起在學(xué)校和托幼機(jī)構(gòu),，69起在度假場(chǎng)所和游船上,。
糞－口途徑是主要傳播方式，也可以通過(guò)污染的水源,、食物,、物品、空氣等傳播,。由于病人的嘔吐物和糞便可形成氣溶膠,，與病人接觸可傳染。隱性感染者及健康攜帶者均可為傳染源,，病人的嘔吐物和糞便在自然界中污染水或間接污染食品,，很容易造成暴發(fā)。暴發(fā)期間空氣和污染物也是不容忽視的傳播媒介,。暴發(fā)中涉及的食物廣泛,，以貝類(lèi)、沙拉,、三明治,、蛋糕、冰霜,、冰塊,、飲水和木莓等直接食用品為主，其中貝類(lèi)很可能來(lái)自污染水域,，NV可以在貝類(lèi)生物體內(nèi)累積,，而且用消滅大腸桿菌的方法不能凈化，木莓也因污水澆灌而遭污染,。
血清抗體調(diào)查表明,，一般NV抗體在童年逐漸獲得，發(fā)展中國(guó)家抗體陽(yáng)性率高于發(fā)達(dá)國(guó)家同年齡組兒童,，如在日本4個(gè)月～1歲的嬰幼兒NLV抗體陽(yáng)性率<10%,，而科威特5～11個(gè)月的嬰幼兒Mexio Virus (MX)和NV抗體陽(yáng)性率分別高達(dá)79%和90%。我國(guó)7～11個(gè)月的嬰幼兒MX和NV抗體陽(yáng)性率分別為36.2%和41.4%,，3歲以后2種抗體的陽(yáng)性率均達(dá)80%以上,。目前認(rèn)為，NV抗體沒(méi)有明顯的保護(hù)作用,，尤其是長(zhǎng)期免疫作用,。約半數(shù)患者病后可獲短期對(duì)同株病毒的免疫，而不能對(duì)其它毒株產(chǎn)生交叉保護(hù)作用,，所以極易出現(xiàn)反復(fù)感染,。
3．臨床特征
感染后潛伏期多在24～48h，少數(shù)在18～72h,。發(fā)病突然,，主要癥狀為惡心,、嘔吐、腹痛和腹瀉,。兒童患者嘔吐普遍,，成人患者腹瀉為多，24h內(nèi)腹瀉4～8次,，糞便為稀水便或水樣便,，無(wú)粘液膿血，糞檢白細(xì)胞陰性,。原發(fā)感染患者的嘔吐癥狀明顯多于續(xù)發(fā)感染者,，有些病人僅表現(xiàn)出嘔吐癥狀，故在臨床曾有冬季嘔吐病診斷,。此外,，頭痛、輕度發(fā)熱,、寒顫和肌肉痛也是常見(jiàn)癥狀,，嚴(yán)重者出現(xiàn)脫水。
4．臨床診斷
20年前,，曾制定了NLV流行的臨床和流行病學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)：糞便細(xì)菌和寄生蟲(chóng)檢測(cè)陰性,；嘔吐患者占病人半數(shù)以上；病程在12～60h,；潛伏期在24～48h,，近來(lái)又將潛伏期修改為12～36h，并補(bǔ)充發(fā)病急,、惡心,、嘔吐、腹瀉,、胃痛和少數(shù)病人發(fā)熱,、發(fā)冷等臨床現(xiàn)象。
5實(shí)驗(yàn)室診斷
5.1標(biāo)本采集
糞便標(biāo)本應(yīng)在發(fā)病首日采集,，至多不能超過(guò)發(fā)病急性期(48～72h)，此時(shí)為稀,、軟便,，病毒排出量最多。一次流行,，至少采集10例患者糞便,，每份標(biāo)本量約1～5ml，成形便和肛拭子診斷意義很小,。標(biāo)本置4℃可存放2～3周,，運(yùn)送也要低溫條件,。病人嘔吐物是糞便標(biāo)本的最佳補(bǔ)充，有助于病原的診斷,。該標(biāo)本的采集,、儲(chǔ)存和運(yùn)送條件同于糞便。從流行病學(xué)角度出發(fā),，在水,、食物或其它外環(huán)境標(biāo)本中檢出NV意義重要。需注意檢測(cè)技術(shù)要鎖定在高度懷疑的傳播媒介上,，盡早采樣并置4℃存放,，若是飲用水，需用大容量(5～100L)濃集病毒后檢測(cè),。
5.2實(shí)驗(yàn)室檢查
5.2.1電鏡法 直接電鏡法(EM)和免疫電鏡法(IEM),，EM 法觀(guān)察的靈敏度較低，要求每毫升糞便樣品中至少有大約 106個(gè)病毒粒子,，因此只能用于患病早期病毒大量排出時(shí)采集的樣本檢測(cè),。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍，主要應(yīng)用患者恢復(fù)期血清捕捉同型抗原,，從而增加檢出率,。電鏡法的缺陷在于設(shè)備昂貴，不能廣泛普及,；檢測(cè)結(jié)果與操作者的技能和經(jīng)驗(yàn)有直接關(guān)系,；靈敏度相對(duì)較低；不適于大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查,。
5.2.2免疫法 包括放射免疫法(RIA),、生物素-親和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)。RIA法的靈敏度比IEM 法可 提高10～100倍,，可以檢測(cè)出抗體升高的水平,，為流行病學(xué)提供更有參考價(jià)值的資料。RIA 法的不足之處在于它需要 6 d,，且需要放射性同位素標(biāo)記,。為了簡(jiǎn)化方法，美國(guó)疾病預(yù)防控制中心建立了生物素-親和素免疫法,，其靈敏度與 RIA 法相當(dāng),，目前該方法已成為美國(guó)疾病預(yù)防控制中心檢測(cè)NLV抗原和抗體的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法之一。1992年Jiang 等重組桿狀病毒表達(dá)NV衣殼蛋白成功后,，建立起的 NV 酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法快速,、靈敏、經(jīng)濟(jì)，其不足之處是免疫反應(yīng)的株型特異性太強(qiáng),，所以應(yīng)用范圍還比較窄,。酶鏈免疫法特異性強(qiáng)，靈敏度高,，診斷迅速,，且較經(jīng)濟(jì)，是目前可廣泛應(yīng)用的檢測(cè)方法,。由于NLV培養(yǎng)還未成功,，原來(lái)用作試劑的病毒抗原數(shù)量受到限制，現(xiàn)在,，用分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以人工重組NV的衣殼蛋白,，從而解決了上述問(wèn)題。
5.2.3分子生物學(xué)檢測(cè)方法
雜交技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)除了能更準(zhǔn)確,、靈敏地檢測(cè)標(biāo)本中的NV,，尤其是低濃度的NV感染外，最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行基因型的研究,，不會(huì)受到獲得分型單克隆抗體的限制,，對(duì)流行病學(xué)研究具有重要意義。
等溫核酸擴(kuò)增法 (NASBA)直接擴(kuò)增RNA 來(lái)檢測(cè) NV,，樣品中病原RNA得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增,，產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳或斑點(diǎn)印跡雜交鑒定結(jié)果。該方法的靈敏度略低于 RT-PCR 法,；整個(gè)過(guò)程只有一步RNA擴(kuò)增,，避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染；縮短了操作時(shí)間,；假陽(yáng)性率低,。
6.食物中NV的檢測(cè)
RT-PCR檢測(cè)食物中NV存在樣品病毒量含量低，樣品量大且成分復(fù)雜等問(wèn)題,，因此病毒富集濃縮,、樣品處理是檢測(cè)的關(guān)鍵，其中有兩個(gè)重要方面影響檢測(cè)結(jié)果,，一是樣品中病毒濃縮后的回收率,，二是抽提核酸的完整程度和純度。
6.1病毒濃縮
NV 濃縮方法一般分為兩大類(lèi),，一類(lèi)為有機(jī)絮凝沉淀法,，主要使用聚乙二醇（PEG）沉淀，PEG 是具有強(qiáng)烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物,，先改變樣品 pH 值，使毒粒與樣品微粒分開(kāi)，PEG 把病毒沉淀下來(lái),，達(dá)到濃縮的目的,。目前對(duì)于固體樣品 PEG 沉淀法是最有效的濃縮方法。
膜過(guò)濾法是另一類(lèi)有效濃縮病毒的方法,，通過(guò)改變膜的pH值使之與帶有電荷的毒粒結(jié)合捕捉病毒,，這種方法通常用在濃縮大體積的黏度小、內(nèi)容顆粒小的液體食品或水中,。檢測(cè)海水,、生活污水中的NV曾用過(guò)這種方法，為瓶裝水和其他飲料濃縮NV提供了參考,。
6.2核酸提取
食品樣品成分復(fù)雜,，所含有的脂肪、蛋白質(zhì),、金屬離子等物質(zhì)都是 RT-PCR 反應(yīng)抑制因子,。NV是單鏈RNA病毒，核酸提取方法的優(yōu)劣取決于兩個(gè)方面：核酸的質(zhì)量和去除抑制因子的能力,。目前應(yīng)用較成熟廣泛的是胍法 RNA 提取法,，即（異）硫氰酸胍-苯酚-氯仿聯(lián)合裂解抽提法，該方法改進(jìn)后制成市售的TRIzol,、RNAzol,、Ultraspec 等產(chǎn)品，與石英砂,、磁珠等多孔顆粒相結(jié)合,，已結(jié)合了poly(dT) 或特異探針的磁珠能較高程度的提純mRNA，去除反應(yīng)抑制因子,。石英砂或磁珠純化 RNA與傳統(tǒng)的有機(jī)試劑（異丙醇,、乙醇）沉淀 RNA 相比起來(lái)，效果較好,，只是成本偏高,。
7.NV腹瀉治療
該病為自限性疾病，通?；颊卟〕淘?8～72h,，有的則更短。目前尚無(wú)特效的抗病毒藥物,，不需用抗菌素,，預(yù)后良好。治療主要是對(duì)癥治療或支持療法,。脫水是NLV腹瀉致死的主要死因,，故對(duì)嚴(yán)重病例，尤其是幼兒及體弱者應(yīng)及時(shí)輸液、糾正水,、電解質(zhì),、酸堿平衡失調(diào)，或口服世界衛(wèi)生組織推薦的口服補(bǔ)液鹽,。
8. 預(yù)防控制措施
8.1 預(yù)防措施
8.1.1健康教育 加強(qiáng)以預(yù)防腸道傳染病為重點(diǎn)的宣傳教育,，提倡喝開(kāi)水，不吃生的半生的食物,，尤其是禁止生食貝類(lèi)等水產(chǎn)品,，生吃瓜果要洗凈，飯前便后要洗手,、養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣,。
8.1.2免疫接種 目前尚無(wú)理想的疫苗。
8.1.3加強(qiáng)飲用水衛(wèi)生 要加快城鄉(xiāng)自來(lái)水建設(shè),。在暫時(shí)達(dá)不到要求的地區(qū),，必須保護(hù)水源，改善飲用水條件,，實(shí)行飲水消毒,。
8.1.4抓好飲食衛(wèi)生 嚴(yán)格執(zhí)行《中華人民共和國(guó)食品衛(wèi)生法》，特別要加強(qiáng)對(duì)飲食行業(yè)（包括餐廳,、個(gè)體飲食店,、學(xué)校周邊飲食攤檔等）、農(nóng)貿(mào)集市,、集體食堂等的衛(wèi)生管理,。食物加工者要嚴(yán)格注意個(gè)人衛(wèi)生，一旦發(fā)病立即調(diào)離工作崗位,。
8.2 病人,、接觸者及其直接接觸環(huán)境的管理
8.2.1隔離：對(duì)病人、疑似病人和帶菌者要分別隔離治療,。
8.2.2突發(fā)疫情報(bào)告：責(zé)任疫情報(bào)告人發(fā)現(xiàn)突發(fā)疫情后,，城鎮(zhèn)于6h內(nèi)，農(nóng)村于12h內(nèi)以最快的通訊方式向發(fā)病地的疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)報(bào)告,。
8.2.3消毒：對(duì)病人,、疑似病人和帶菌者的吐瀉物和污染過(guò)的物品、空氣,、飲用水,、廁所等進(jìn)行隨時(shí)消毒，當(dāng)染菌者送隔離病房或治愈后進(jìn)行終末消毒,。
8.3 流行期措施：
8.3.1開(kāi)展群眾性愛(ài)國(guó)衛(wèi)生運(yùn)動(dòng),，搞好環(huán)境衛(wèi)生,，及時(shí)清除、處理垃圾和人畜糞便,。
8.3.2做好水源保護(hù)和飲用水消毒,。
8.3.3加強(qiáng)食品衛(wèi)生法的執(zhí)法力度,，做好食品衛(wèi)生監(jiān)督管理工作,。
8.3.4做好腸道傳染病的衛(wèi)生防病宣傳教育和動(dòng)員工作，在發(fā)生流行時(shí)發(fā)動(dòng)群眾自覺(jué)停止一切宴請(qǐng)聚餐,，發(fā)生吐,、瀉時(shí)及時(shí)到醫(yī)院腸道門(mén)診就醫(yī)。
8.3.5加強(qiáng)腸道門(mén)診工作,，作到逢瀉必檢,，逢疑必報(bào)。對(duì)發(fā)現(xiàn)的病人及時(shí)隔離治療,。
8.3.6加強(qiáng)飲食衛(wèi)生,，禁食生、半生食物,。
8.3.7加強(qiáng)個(gè)人衛(wèi)生,，及時(shí)用肥皂或洗手液洗手，待肥皂泡持續(xù)10秒后沖洗干凈,。
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