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一,、ELISA檢測人杯狀病毒

采用IDEIA? Norovirus試劑盒（DakoCytomation公司）,，僅限于檢測人杯狀病毒中的諾如病毒（屬）GⅠ和GⅡ型,。

（一）檢測前準備工作

1.糞便標本處理：加入1ml樣品稀釋液（sample diluent）至1.5ml EP管中,，加入0.1g固體糞便標本或0.1ml液體糞便標本,，置于漩渦震蕩器混勻，室溫靜置10min,，室溫下≥5000rpm離心5min,。

2.陰性對照：將1ml樣品稀釋液（sample diluent）加至標記好的小瓶中作為陰性對照。

3.陽性對照：1ml對照稀釋液（control diluent）溶解陽性對照,，使用前混勻,。

4.洗液的配制：1倍體積的洗液濃縮液，加9倍體積的去離子H₂O,。當天用當天配,。

（二）標本檢測

1.    將需要數(shù)量的微孔板置于微孔板架上。

2.    每孔加入100μl 10％便懸液或陰性對照或陽性對照（每次檢測均需加一個陽性對照和一個陰性對照）,，20～30℃靜置60±5min,。

3.    每孔加入2滴（或100μl）酶結合物（conjugate），用槍頭輕柔混勻,。

4.    每孔加入350μl洗液,，洗5次，在衛(wèi)生紙上拍干,。

5.    每孔加入2滴（或100μl）底物液（Substrate）,，20～30℃靜置30min。待藍色顯現(xiàn)后迅速觀察顏色,。

6.    每孔加入2滴（或100μl）終止液（Stop solution）,，充分混勻。

7.    讀取OD450值,，打印輸出或記錄OD值,。結果必須在加入終止液后30min內(nèi)讀取。

(三) 檢測結果的判定：

1.    陰性對照：肉眼觀察無色或OD450值<0.15,。

2.    臨界值：OD450值＝陰性對照OD450值＋0.10,。

3.    陽性對照：肉眼觀察呈現(xiàn)獨特的藍色或OD450值>0.50。

4.    標本：肉眼觀察藍色比陰性對照顏色深判定為陽性，肉眼觀察無色判定為陰性,；或者OD450值大于臨界值判定為陽性,，小于臨界值判定為陰性，OD450值在臨界值±0.01范圍內(nèi)判定為可疑,，應重復檢測,。

（四）注意事項：

1.打開后的96微孔板應置于可封口的有干燥劑的口袋中貯存于2～8℃，打開后6周內(nèi)用完,。

2.終止液中含0.3mol/L硫酸，避免接觸到皮膚和粘膜,。如果終止液接觸到這些部位立即用水沖洗,。

3.未用完的陽性對照可在2～8℃貯存1個月，長期貯存應分裝存于-20℃,。

4.底物液避光保存,，不要使用已經(jīng)變藍的底物液。

5.避免污染,。

二,、人杯狀病毒RT-PCR檢測

可以同時檢測出人杯狀病毒中諾如病毒（屬）和扎如病毒（屬）。

（一）病毒RNA提?。?/span>

1．提取前的準備工作：

（1）    將1ml Buffer AVL加入裝有低壓凍干的Carrier RNA中,，徹底溶解Carrier RNA后，將溶有Carrier RNA的Buffer AVL轉(zhuǎn)入至Buffer AVL瓶中,，徹底混勻,。分裝貯存于2～8℃。如果在2～8℃時,，Buffer AVL/Carrier RNA溶液形成沉淀,，可在80℃重新溶解，注意加熱的時間不能超過5min,，用前冷卻至室溫,。Buffer AVL/ Carrier RNA溶液不能加熱超過6次。

（2）    加入合適比例的96～100％的酒精至Buffer AW1中,，19ml的Buffer AW1加入酒精25ml,。

（3）    加入合適比例的96～100％的酒精至Buffer AW2中，13ml的Buffer AW2加入酒精30ml,。

2．病毒RNA的提?。?/span>

（1）    在1.5ml EP管中加入560μl 已加入Carrier RNA的Buffer AVL。

（2）    將140μl 10％便懸液加入至EP管中的Buffer AVL中,，vortex混勻15sec,。

（3）    室溫（15～25℃）孵育10min。

（4）    將1.5ml EP管輕微離心，以去除管內(nèi)的液滴,。

（5）    在管內(nèi)加入560μl 96～100％的酒精,，vortex混勻15sec?；靹蚝?，將1.5ml EP管輕微離心，以去除管內(nèi)的液滴,。

（6）    小心的將630μl步驟5中的溶液加入至已放入至2ml收集管中的QIAamp離心柱中,，注意不要弄濕柱子邊緣。蓋上蓋子,，8000rmp離心1min,。將QIAamp離心柱放置至另一干凈的2ml收集管中，棄去包含有濾過液的收集管,。

（7）    小心打開QIAamp離心柱的蓋子,，重復步驟6。

（8）    小心打開QIAamp離心柱的蓋子,，加入500μl Buffer AW1,。蓋上蓋子，8000rmp離心1min,。將QIAamp離心柱放置至另一干凈的2ml收集管中,，棄去包含有濾過液的收集管。

（9）    小心打開QIAamp離心柱的蓋子,，加入500μlBuffer AW2,。蓋上蓋子，14,000rmp離心3min,。棄去收集管中的濾過液,，14,000rmp離心空柱子1min。

（10）將QIAamp離心柱放置入干凈的1.5ml離心管中,。棄去包含有濾過液的收集管,。小心打開QIAamp離心柱的蓋子，加入60μl Buffer AVE至離心柱中,，蓋上蓋子,，室溫孵育1min。8000rmp離心1min,。（2×40μl的Buffer AVE洗脫兩次,，能增加產(chǎn)量。）病毒RNA進行反轉(zhuǎn)錄,，或貯存于－20℃或－70℃備用,。

（二）人杯狀病毒ssRNA的反轉(zhuǎn)錄：

在0.2mlEP管中配制如下逆轉(zhuǎn)錄體系,。

10×緩沖液                        2.5 μl

25 mM MgCl2                        4 μl

2.5mM dNTPs                         5μl

1% BSA                                2.5μl

0.2 μg/ μl引物289混合液        1μl

10 U/μl AMV-RT                0.35μl

50 U/μl RNasin                      0.1μl

DEPC處理H2O                  8.05μl

RNA                                      1.5μl

共25μl，混勻,，輕微離心,，42℃反轉(zhuǎn)錄1hr。

（三）人杯狀病毒cDNA PCR擴增

在0.2ml EP管中配制如下PCR體系：

10×緩沖液　　　　　　　　5μl

25mM MgCl2　　　　　　　 4μl

10mM dNTPs　　　　　　　 1μl

0.2 μg/ μl引物289混合液　 1μl

0.1μg/ μl引物290混合液　　1μl

5 U/μl Taq酶　　　　　 0.4 μl

DEPC處理H2O　　　　　  29.6μl

cDNA　　　　　　　　　    8μl

共50μl,，混勻,，輕微離心，放入PCR儀中擴增,，反應條件：94℃變性3min后,，94℃ 60s，58℃1min20s,，72℃1min,，進行30個循環(huán)，72℃延伸10min,。反應結束后1.5％瓊脂糖凝膠電泳或4℃保存PCR產(chǎn)物。

表1  人杯狀病毒RT-PCR所用的引物

引物	位置	方向	核酸序列(5’–3’)
289H	4865-4886	-	TGACGATTTCATCATCACCATC
289I	4865-4886	-	TGACGATTTCATCATCCCCGTC
290H	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGACTCCAC
290I	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGACTCAAC
290J	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGATTCAAC
290K	4568-4590	+	GATTACTCCAGGTGGGATTCCAC

（四）檢測結果的判定：

取15μl RT-PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,。人杯狀病毒諾如屬擴增產(chǎn)物大小為319bp,，扎如屬擴增產(chǎn)物大小為331bp。

（五）注意事項：

1.    槍頭避免觸及QIAamp離心柱的濾過膜,。

2.    避免污染,。應該戴手套進行操作。PCR實驗室應該分為3個區(qū)：試劑準備區(qū),，樣品準備區(qū),，擴增和檢測區(qū)。

3.    EB可能致癌,，必須小心操作,，劃定EB污染區(qū)。